Cómo contar el número de células

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Por Jennifer Stearns, Michael Surette

Los experimentos microbianos a menudo requieren que sepamos cuántas bacterias, por ejemplo, están presentes. Conocer el número de células microbianas ayuda a indicar si las células están creciendo o muriendo y ayuda a que los experimentos sean consistentes día a día.

Los métodos para descifrar el número de células presentes de forma fácil y precisa se utilizan en los laboratorios de microbiología todos los días. Estos incluyen métodos directos en los que las colonias se cuentan directamente y métodos indirectos en los que se hace una estimación del número de células.

Métodos directos de recuento de células

La determinación del número de células bacterianas que están vivas en una muestra se realiza utilizando recuentos viables. Cada método para calcular el número viable de organismos aprovecha el hecho de que cuando una suspensión de bacterias se platea en un medio sólido, cada célula bacteriana viva crecerá para formar una colonia, que es lo suficientemente grande para ser vista.

Cuando la concentración de bacterias en una muestra es alta, debe diluirse lo suficiente para que las colonias sean distintas entre sí, lo que se hace con dilución en serie.

En la figura, un cultivo de bacterias se diluye repetidamente añadiendo un volumen fijo al primer tubo (la primera dilución) y luego tomando un volumen fijo del primer tubo y añadiéndolo al segundo (la segunda dilución). Esto se repite varias veces (por eso se llama dilución en serie) en un esfuerzo por diluir el cultivo bacteriano original.

Un pequeño volumen de cada dilución se deposita en el agar y las células bacterianas individuales forman cada una una colonia. El aumento de las diluciones resultará en una disminución del número de bacterias presentes y, por lo tanto, en una disminución del número de colonias en cada placa de agar. El número de colonias se utiliza para calcular hacia atrás y determinar el número exacto de células que estaban presentes en la muestra original.

Para calcular el número de células viables en la muestra original, el número de colonias presentes después de incubar las placas se multiplica por el factor de dilución. El número de células de una muestra suele expresarse como unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen (en este caso mL) o UFC/mL.

Cuando el número de células en una muestra es muy bajo, como en el agua del lago, un gran volumen de la muestra puede pasar a través de un filtro, que luego se cultiva con el medio adecuado para producir colonias del microbio de interés. En este caso, el número de colonias se divide por el volumen de muestra filtrada.

Por ejemplo, si 5 litros (L) de agua de lago fueron filtrados y 100 colonias aparecieron después de la incubación, entonces el número original de bacterias en el agua fue de 100 colonias/5 L = 20 CFU/L.

Otra forma de contar el número de células de una muestra es mediante recuentos microscópicos directos. Con este método, se cuentan todas las células de la muestra, ya sean vivas o muertas, pero le da una estimación inmediata del número de bacterias sin necesidad de incubar una muestra durante 24 horas o más.

Métodos indirectos de recuento de células

Aunque no son tan precisos, los métodos indirectos son más rápidos y convenientes que los métodos directos para estimar el número de microbios en una muestra.

La turbidez es la cantidad de luz que se dispersa causada por las células en un cultivo líquido. Una máquina llamada espectrofotómetro pasa un haz de luz a través de un tubo transparente que contiene un cultivo bacteriano. A medida que aumenta el número de células en un cultivo, se dispersa más luz y menos de ella pasa a través del tubo para ser registrada en el otro lado.

La turbidez se expresa como absorbancia y como densidad óptica (OD). Cuanto mayor sea el número (entre 0 y 2), más concentradas estarán las células de la solución.

Otra forma de estimar indirectamente el número de células es medir la actividad metabólica de la muestra para un sustrato específico. De esta manera, la cantidad de residuos producidos, ya sea un gas que se puede capturar y medir o un metabolito que se puede utilizar con un indicador en el medio, se puede utilizar para calcular cuántas células en crecimiento hay en el cultivo.

El último método para estimar indirectamente el número de células es calcular el peso seco del organismo en cultivo. Este método se utiliza a menudo con hongos que forman largas colonias filamentosas que no se rompen fácilmente por dilución. La muestra se concentra y se retira el líquido. A continuación, las células se secan y se pesan.

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